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Universität Basel

Von pluripotenten Stammzellen

Yves-Alain Barde

Embryonale Stammzellen sind pluripotent, können sich also zu jedem Zelltyp eines Organismus entwickeln. Sie haben die biomedizinische Forschung revolutioniert. In den kommenden Jahren dürfte induzierten pluripotenten Stammzellen eine noch grössere Bedeutung zukommen.

Eine Stammzelle besitzt die einzigartige Eigenschaft, sich selbst zu erneuern: Durch Zellteilung kann sie eine identische Kopie von sich selbst herstellen und sich über einen unbegrenzten Zeitraum teilen. Eine pluripotente Stammzelle verfügt zudem über ein ausserordentliches Entwicklungspotenzial: Aus ihr können alle Zelltypen eines ausgewachsenen Organismus hervorgehen, einschliesslich Keimzellen wie Eizellen und Spermien. Die Kombination dieser beiden Eigenschaften – Selbsterneuerung und Pluripotenz – sind charakteristisch für embryonale Stammzellen. Solche Zellen sind nicht mit befruchteten Eizellen zu verwechseln. Diese sind «totipotent», und zur Entfaltung ihres vollen Differenzierungspotenzials müssen einige Zellteilungen und eine erhebliche Umprogrammierung stattfinden: Die befruchtete Eizelle startet als hoch spezialisierte Zelle, kann sich aber wie eine embryonale Stammzelle nach Zellteilung und De-Differenzierung nicht nur in alle Zelltypen des erwachsenen Organismus entwickeln, sondern auch extraembryonales Gewebe einschliesslich des Trophoblasten, der Plazenta von Säugetieren, bilden. Embryonale Stammzellen hingegen sind grundsätzlich nicht in der Lage, Trophoblasten zu bilden, ausser sie wurden durch Manipulation beispielsweise mit vier Chromosomensätzen (tetraploid) ausgestattet. Sie werden deshalb als «pluripotent» und nicht als «totipotent», dem charakteristischen Merkmal der befruchteten Eizelle, bezeichnet.

Nicht alle Stammzellen pluripotent
Wenn sich eine Stammzelle symmetrisch teilt, bleiben beide identischen Tochterzellen Stammzellen – eine Eigenschaft, die sowohl für embryonale Stammzellen als auch für erwachsene, auch Gewebestammzellen genannt, zutrifft. Gewebestammzellen besitzen zwar ebenfalls unbegrenzte Kapazitäten zur Selbsterneuerung, verfügen aber nur über ein eingeschränktes Differenzierungspotenzial. Diese Eigenschaft gewährleistet die kontinuierliche Versorgung mit spezifischen Untergruppen differenzierter Zellen, die der Organismus während seines gesamten Lebens benötigt. Denn die meisten Gewebe bestehen aus Zellen mit begrenzter Lebensdauer und müssen daher kontinuierlich ersetzt werden. So werden beispielsweise im Menschen täglich mehrere Milliarden von blutbildenden Zellen erneuert. Die Nachkommenschaft dieser blutbildenden Stammzellen ist bemerkenswert vielfältig und umfasst sowohl rote Blutkörperchen (Erythrozyten) als auch B-Lymphozyten und andere ausdifferenzierte Zelltypen. Gewebestammzellen besitzen nur ein beschränktes Differenzierungspotenzial, was aber nicht bedeutet, dass ihre Eigenschaften deshalb weniger interessant wären als jene embryonaler Stammzellen. Im Gegenteil: Das begrenzte Differenzierungspotenzial der Gewebestammzellen ist entscheidend für die gesicherte Versorgung des Organismus mit organspezifischen Nachkommen, die Grundvoraussetzung für eine lebenslange Aufrechterhaltung des Gleichgewichtszustands, auch Homöostase genannt. Die symmetrische Zellteilung von Stammzellen ist ein ausgeklügelter und streng überwachter Prozess. Er verläuft über sehr lange Zeiträume und kann, wie Transplantationen blutbildender Stammzellen gezeigt haben, sogar über die normale Lebensspanne hinausgehen. Demnach müssen Stammzellen über spezielle Überwachungs- und Wartungsmechanismen verfügen, die sicherstellen, dass die Zellteilung ohne Fehler abläuft und die Integrität des Genoms erhalten bleibt. Zudem sind spezielle Fähigkeiten erforderlich, welche die Verkürzung von Chromosomen verhindern, die bei der Teilung «einfacher» Zellen auftritt. Zahlreiche Zelltypen können sich teilen, wobei mit jeder Zellteilung die Zelle altert. Die Anzahl der Zellteilungen ist für kultivierte Mauszellen auf rund 15 und für humane Zellen auf etwa 40 bis 50 beschränkt. Ein Grund dafür ist die Verkürzung der Chromosomen. Dieser Vorgang, häufig als «Seneszenz» bezeichnet, wird in Stammzellen durch verschiedene Mechanismen verhindert, unter anderem durch eine hohe Aktivität des Enzyms Telomerase. Dieses Enzym bewahrt die Chromosomen vor Verkürzungen während der Zellteilung. Eine hohe Telomerase-Aktivität ist aber nicht nur für Stammzellen, sondern auch für Krebszellen charakteristisch und damit ein weiterer Grund, warum die Erforschung der Biochemie und Zellbiologie von Stammzellen einen sehr wichtigen Platz in der aktuellen biomedizinischen Forschung einnimmt.

Warum so wertvoll?
Pluripotenz und die unbeschränkte Kapazität zur Selbsterneuerung sind aussergewöhnliche Fähigkeiten. Es stellt sich deshalb die Frage, weshalb es überhaupt solche Zellen gibt und woher sie kommen (siehe Kasten links). Dahinter verbirgt sich eine lange Geschichte. Sie beginnt mit den tumorauslösenden Eigenschaften der Keimzellen von besonderen Mausstämmen und findet ihren ersten Höhepunkt in der von Neugier vorangetriebenen Grundlagenforschung in den Laboratorien von Martin Evans in Cambridge (Grossbritannien) und Gail Martin in San Francisco (USA) im Jahr 1981: Die Isolierung und Kultivierung embryonaler Stammzellen war ein besonders wichtiger Meilenstein, und das Potenzial dieser Zellen wurde schnell erkannt. Es wurde nämlich dazu genutzt, durch gezielte Mutationen des Mausgenoms spezifisch veränderte Mäuse zu erzeugen. Diese Errungenschaft hat die biomedizinische Forschung revolutioniert und wurde 2007 mit der Verleihung des Nobelpreises für Medizin an Mario Capecchi, Martin Evans und Oliver Smithies gewürdigt. Wie auch bei Viren und Bakterien erfolgt die Isolierung solch spezifisch mutierter Zellen durch die Selektion eingefügter Antibiotikaresistenzen. Die so isolierten Zellen können sich selbst erneuern und bleiben zugleich pluripotent. Damit eine Mutation im Genom von embryonalen Stammzellen aber wirklich nützt, muss sie auch auf die Nachkommenschaft übertragen werden können. Das heisst: Die veränderten embryonalen Stammzellen müssen in der Lage sein, die Keimbahn zu besiedeln, damit die Mutation an die nächste Generation weitergegeben werden kann. Erst die Kultivierung embryonaler Stammzellen unter definierten und reproduzierbaren Bedingungen hat eine detaillierte Analyse ihres Genexpressionsmusters möglich gemacht. Nur so konnten wichtige Transkriptionsfaktoren identifiziert und der LIF(Leukämie inhibierender Faktor) -Signalweg genau erforscht werden. Die Resultate mündeten schliesslich in dem von Austin Smiths Labor formulierten Konzept, dass die Pluripotenz einem «Grundzustand» entspricht, in dem embryonale Stammzellen verharren, solange sie keine extrazellulären Signale erhalten. Dieser Zustand ist instabil, wobei diese Instabilität gewährleistet, dass während der Weiterentwicklung keine Zelle mit den charakteristischen Eigenschaften embryonaler Stammzellen zurückbleibt. Wie erwähnt, sind sich embryonale Stammzellen und Krebszellen in signifikanten Eigenschaften ähnlich: in der unbegrenzten Zellteilung und der hohen Telomerase-Aktivität. Bei den Untersuchungen der Molekularbiologie der Pluripotenz der embryonalen Stammzelle zeigte sich, dass zwei die Pluripotenz kennzeichnende Transkriptionsfaktoren – Oct4 und Sox2 – die Genexpression des Wachstumsfaktors Fibroblast Growth Factor 4 (FGF4) direkt aktivieren. Dieser Faktor sorgt dafür, dass während der normalen Entwicklung keine embryonalen Stammzellen zurückbleiben. Umgekehrt kann durch eine Blockierung des FGF-Signalwegs der pluripotente Status embryonaler Stammzellen aufrechterhalten werden – eine bahnbrechende Entdeckung, die erst den Weg für die Isolierung embryonaler Stammzellen aus genetisch unterschiedlichen Mausstämmen, und letztlich sogar aus Ratten, eröffnete.

Pluripotente Zellen auch beim Menschen?
Angesichts des pluripotenten Charakters embryonaler Stammzellen von Mäusen und ihrer Fähigkeit, sich unter bestimmten Bedingungen in verschiedene Zelltypen zu entwickeln, kommt der Frage nach der Existenz humaner embryonaler Stammzellen eine erhebliche Bedeutung zu. Bereits 1998 isolierte Jamie Thomson in Madison (Wisconsin, USA) mit embryonalen Stammzellen der Maus vergleichbare Zellen aus humanen Blastozysten. Ob diese Zellen jedoch pluripotent sind, ist derzeit noch unklar. Den endgültigen Beweis dafür kann im Prinzip nur der Test der Keimbahnübertragung bringen, ein Test, dessen Durchführung beim Menschen jedoch ausser Frage steht. Arbeiten mit Primaten, die in verschiedenen Laboratorien bereits aktiv vorangetrieben werden, sind eine wichtige Alternative. Der Erfolg von Thomson zeigt aber bereits, dass die Isolierung humaner Zellen mit interessanten Eigenschaften und hohem Differenzierungspotenzial schon jetzt möglich ist, sogar ihre Kultivierung und Nutzung für die In-vitro-Entwicklung von sehr komplexen Strukturen. So züchtete Yoshiki Sasais Laboratorium in Kobe (Japan) 2012 in vitro erfolgreich sogar Augen! Im Kontext des auf kultivierten Stammzellen basierenden Organersatzes ist dies ein sehr bedeutendes, zudem ermutigendes Resultat. Dennoch sind die Voraussetzungen, die humane embryonale Stammzellen im undifferenzierten Zustand verharren lassen, noch kaum verstanden. Nur wenige einzelne humane Zellen scheinen auf LIF anzusprechen, ein Umstand, den unser Labor am Biozentrum in Basel benutzt, um stabile, möglicherweise pluripotente humane embryonale Stammzellen zu selektionieren und zu kultivieren. Die meisten Forschungsgruppen verwenden statt LIF den Wachstumsfaktor FGF für die Vermehrung humaner Zellen, wobei noch unklar ist, ob so stabile, möglicherweise pluripotente Stammzellen kultiviert werden können. Vielmehr scheinen die so kultivierten humanen Stammzellen eher bereits «vorgeprägten» Prof. Dr. Yves-Alain Barde ist Ordinarius für Neurobiologie am Biozentrum der Universität Basel. Maus-Stammzellen zu entsprechen. Diese vorgeprägten Zellen sind nicht pluripotent, da bei ihnen die Differenzierungsrichtung schon festgelegt ist, und können beispielsweise die Keimbahn nicht besiedeln. Um zuverlässige Standards für reprogrammierte oder induzierte «pluripotente» humane Stammzellen (iPS) zu etablieren, bedarf es noch sehr viel Arbeit.

Reprogrammierung von Zellen
Fortschritte in der Aufklärung der Pluripotenz sowie der ausserordentlich wichtige Hinweis, dass sich schon differenzierte Säugerzellen mittels aktivierter Eizellen vollständig reprogrammieren lassen (das sogenannte «Dolly»-Experiment von Ian Wilmut und Kollegen), führten schliesslich zu einem bahnbrechenden Experiment, für das der Japaner Shinya Yamanaka 2012 den Nobelpreis für Medizin erhielt. Ihm gelang die Reprogrammierung von Zellen in vitro unter genau definierten und reproduzierbaren Bedingungen. Die Zugabe von vier Kernfaktoren zu ausdifferenzierten Zellen, gekoppelt mit einem effizienten Selektionssystem, führte zur Reprogrammierung, das heisst zur De-Differenzierung von schon differenzierten Zellen. Darüber hinaus gelang es in Mäusen, diese induzierten «pluripotenten» Stammzellen so weit zu reprogrammieren, dass sie sogar zur Keimbahn beitragen. Die Herstellung induzierter «pluripotenter» Stammzellen ist von enormer Bedeutung. Sie erlaubt die Vermehrung humaner Zellen in unbegrenzter Zahl und ihre Differenzierung in spezifische Zelltypen. Damit eröffnen sich nicht nur neue Wege, Auswirkungen von Mutationen in relevanten zellulären Kontexten zu studieren, sondern auch bessere Möglichkeiten, neue Wirkstoffe zu entwickeln und zu testen. Für den Einsatz induzierter «pluripotenter» Stammzellen als sicherer Ersatz für Organtransplantationen steht jedoch noch ein langer Weg bevor. Dies nicht zuletzt, weil die Studien zur Genomstabilität humaner induzierter pluripotenter Stammzellen noch in den Kinderschuhen stecken. Solche Studien sind allerdings unumgänglich, wie entsprechende Arbeiten mit induzierten embryonalen Stammzellen von Mäusen eindrucksvoll belegen.

Embryonale Stammzellen: Mehr als ein wertvolles Artefakt? Embryonale Stammzellen werden in Gegenwart eines spezifischen Wachstumsfaktors, dem sogenannten «Leukaemia Inhibitory Factor» (LIF), kultiviert. Dieser wird für die Aufrechterhaltung der Pluripotenz benötigt, wenn embryonale Stammzellen in Kultur gehalten werden. Das etwas seltsam benannte Protein (ein Umstand, der die verschlungenen Wege seiner Entdeckung reflektiert) wird durch «Feeder- Zellen» freigesetzt und ist entscheidend für die erfolgreiche Isolierung embryonaler Stammzellen. Lange Zeit war die Bedeutung von LIF während der normalen Mausentwicklung unklar, da sich Embryos auch in Abwesenheit von LIF problemlos entwickeln. Bis heute sind Nager die einzige zuverlässige tierische Quelle echter embryonaler Stammzellen. Dies ist vermutlich einer speziellen adaptiven Fähigkeit zuzuschreiben, der sogenannten Diapause. Dabei handelt es sich um eine Entwicklungspause der Blastozyste, dem Ursprungsgewebe embryonaler Stammzellen. In Nagetieren können Eier auch dann befruchtet werden, wenn das Muttertier noch säugt. Die befruchteten Eier verharren so lange im Zustand der Blastozyste, bis die Entwicklung des Embryos nach der Entwöhnung normal fortgesetzt wird. Damit der Zustand der Blastozyste aufrechterhalten werden kann, braucht es ein funktionierendes LIF-Signalsystem. Sobald wichtige Elemente des Signalwegs ausgeschaltet werden, ist die innere Zellmasse der in der Diapause ruhenden Blastozysten nicht lebensfähig. Es scheint demnach, dass kultivierte embryonale Stammzellen der inneren Zellmasse ruhender Blastozysten entsprechen. Diese und viele andere im Text erwähnte Experimente zur Biologie embryonaler Stammzellen wurden im Labor von Austin Smith (Cambridge, Grossbritannien), der 2010 mit dem Louis-Jeantet-Preis ausgezeichnet wurde, durchgeführt.

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